1922年，毛泽东创办了湖南青年图书馆，杨开慧主持图书馆的一切事务。同年10月，杨开慧生了第一个孩子，取名毛岸英。杨开慧一边带孩子，一边协助毛泽东工作。1923年4月，毛泽东到上海党中央工作，任中共中央组织部长。同年11月，次子毛岸青在板仓家中出生。1924年，杨开慧带着岸英和岸青两个孩子也来到了上海，并同向警予一起去纱厂组织女工夜校，为此还专门学习用上海话讲课。
1925年2月，随毛泽东回到韶山开展农民运动，协助毛泽东创办农民夜校，在农民夜校担任教员。她不仅一直照顾丈夫生活并带孩子，也帮助联络同志，还帮毛泽东找资料、抄写文章。
同年12月，离开韶山转往广州协助毛泽东收集、整理资料，编写文稿，负责联络工作。
1926年，随毛泽东在广州开展革命工作。
1927年初，毛泽东对湖南农民运动进行考察，杨开慧把大量的调查材料进行分类整理，工整地抄写下来。3月，毛泽东《湖南农民运动考察报告》在中共湖南区委机关报《战士》上首次刊登，里面也凝聚了杨开慧的心血。同年4月，三子毛岸龙在武昌出生。
“八七”会议后，毛泽东潜回湖南，赶到板仓看望在此隐蔽的妻子和三个孩子，又在杨开慧陪伴下潜入长沙，住进了岳父留下的那座挂着“板仓杨”匾额的房子。毛泽东日夜进行暴动的准备，杨开慧则照料着丈夫的生活。8月底，毛泽东去指挥秋收起义，行前嘱咐杨开慧照顾好孩子，参加一些农民运动。杨开慧给丈夫带上草鞋，要堂弟杨开明送一程，并叮嘱毛泽东最好扮成郎中（医生）。这次话别，是这对夫妇的永诀。
此后，杨开慧独自带着孩子回到长沙板仓开展地下斗争。面对严重白色恐怖，在与上级组织失去联系的情况下，杨开慧参与组织和领导了长沙、平江、湘阴等地武装斗争，发展党的组织，坚持斗争整整3年。
被捕牺牲
1930年，红军两次攻打长沙。湖南军阀何键把对朱、毛红军的仇恨都发泄到杨开慧身上。他出了1000银元的
赏格捉拿杨开慧。杨开慧在群众的掩护下，几次都逢凶化吉躲过了敌人的追捕，但在同年10月24日，杨开慧潜回板仓看望母亲和孩子，被军阀密探发现后被逮捕。
1930年11月14日，杨开慧于浏阳门外识字岭英勇就义，年仅29岁。
在江西指挥红军反“围剿”的毛泽东得知杨开慧牺牲的消息，寄信给杨家说：“开慧之死，百身莫赎。”
解放后，毛泽东仍常怀念杨开慧。1957年，他给故人柳直荀的遗孀李淑一回信时，写下了《蝶恋花·答李淑一》，第一句就是“我失骄杨君失柳”。对女子的称呼本应用“娇”字，当年推荐杨昌济去北京大学任教的章士钊曾“骄杨”当作何解，毛泽东则说：“女子为革命而丧其元（头），焉得不骄？”